Полімеразна ланцюгова реакція

План

Історія 3

Принцип дії 5

Необхідні компоненти. 5

Праймери. 6

Хід реакції 7

Різновіди ПЛР. 8

Використання 11

Ізоляція генетичного матеріалу. 12

Секвенування ДНК і виявлення генетичних хвороб. 13

Методи рекомбінації ДНК. 13

Використання в криміналістиці та встановлення батьківства 13

Ампліфікація та вимірювання кількості ДНК. 14

Аналіз стародавньої ДНК. 14

Ідентифікація вірусної ДНК. 14

Оцінка кількості ДНК і визначення експресії генів. 15

Використана література 16


Полімеразна ланцюгова реакція
(ПЛР або PCR) — експериментальний метод молекулярної біології, спосіб значного збільшення малих концентрацій бажаних фрагментів ДНК в біологічному матеріалі (пробі). Крім простого збільшення числа копій ДНК (цей процес називається ампліфікацією), ПЛР дозволяє проводити безліч інших маніпуляцій з генетичним матеріалом (введення мутацій, зрощення фрагментів ДНК), і широко використовується в біологічній і медичній практиці, наприклад для клонування генів, введення мутацій, виділення нових генів, секвенування, для створення генетично модіфікованих організмів, діагностики захворювань (спадкових, інфекційних), ідентифікації малих кількостей ДНК, встановлення батьківства.

Історія

Полімеразна ланцюгова реакція була відкрита Карі Муллісом[1][2]. Він був нагороджений Нобелівською премією з хімії 1993 року за це відкриття, через сім років після того, як він і його колеги з корпорації Cetus запропонували його для практичного використання. Вперше метод був винайден у 1983 році, під час роботи Мулліса в компанії Cetus в місті Емерівіль (Каліфорнія), одній з перших біотехнологічних компаній

Його задачею було створення коротких ланцюжків ДНК для інших учених. Мулліс писав, що ідея ПЛР прийшла йому, коли він вночі в своєму автомобілі їхав уздовж Каліфорнійського шосе 1[1]. Він продумував новий шлях аналізу змін (мутацій) в ДНК, коли усвідомив, що замість цього він винайшов метод ампліфікації будь-якої ділянки ДНК за допомогою повторних циклів дублювання, які б здійснював фермент ДНК-полімераза. В журналі Scientific American Мулліс підвів подсумок метода: «Починаючи з єдиної молекули ДНК, носія генетичної інформації, ПЛР може надати 100 мільярдів подібних молекул за кілька годин. Реакцію дуже легко провести, вона вимагає однієї тестової трубки, незначної кількості реагентів, та джерела тепла»[3].

Фермент ДНК-полімераза зустрічається природно в живих організмах. В живих клітинах він виконує функції реплікації ДНК протягом мітозу та мейозу. Полімераза працює, зв'язуючись з одним ланцюжком ДНК та синтезуючи інший, створюючи подвійну спіраль. У першому прототипі процесу ПЛР, фермент використовувався in vitro (у контролюємому оточенні за межами організму). Дволанцюгова молекула ДНК розділялася на окремі ланцюжки за допомогою нагрівання до 94 °C. При цій температурі, проте, ДНК-полімераза, що використовувалася на той час, гинула, тому фермент доводилося додавати після стадії нагрівання на кожному циклі реакції. Оригінальна процедура була дуже неефективна, тому що вимагала вимагало багато часу, великих кількостей ДНК-полімерази, і безперервної уваги протягом всього процесу.

Пізніше, цей оригінальний процес ПРЛ був значно вдосконалений використанням ДНК-полімерази, взятої з термофільних (теплолюбивих) бактерій, що зазвичай ростуть в гейзерах в температурі понад 110 °C. ДНК-полімераза, взята з цих організмів, стійка при високих температурах, і при використанні у ПЛР не пошкоджується при нагріванні до необхідної температури. З тих пір, як необхідніть додавати нову ДНК-полімеразу на кожному циклі зникла, процес копіювання ДНК був спрощений і автоматизований.

Одна з перших

1 2 3 4 5 6